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来源: 《Skin Res Technol》
作者:李尚圭, 咸瑞允, 李珠熙, 张有珍
皮肤老化是皮肤密度和弹性下降的特征,是那些想要保持年轻外表的人普遍关心的问题。锌-α2-糖蛋白 (ZAG) 由各种体液分泌,与脂肪分解有关,并被确定为特应性皮炎生物标志物。本研究评估了 ZAG 肽的潜力,它具有抗衰老等多种益处。
材料和方法
我们对眼眶周围皱纹明显的患者 ( n = 22)进行了为期 4 周的临床试验, 使用含 ZAG 肽的产品。分别使用 Cutometer Dual MPA580、Ultrascan 和 Antera 3D CS 评估产品对皮肤密度、弹性和眼眶周围皱纹深度的影响。体外评估了 ZAG 肽对 UVB 处理的角质形成细胞的影响,以了解其对抗皮肤屏障功能受损、胶原蛋白降解和衰老的潜在机制。此外,分别使用细胞计数试剂盒测定和定量逆转录聚合酶链反应评估了 ZAG 肽对细胞活力以及衰老和皮肤屏障相关基因表达的影响。
结果
患者的皮肤密度和弹性均有所改善,眼眶周围皱纹减少。此外,超过 85% 的患者对该产品的抗衰老效果感到满意。此外,ZAG 肽可降低 SA-β-半乳糖苷酶染色,下调衰老相关基因,并上调 UVB 照射角质形成细胞中的皮肤屏障功能相关基因。
结论
我们的临床和体外研究结果表明,ZAG 肽具有抗衰老作用并改善皮肤屏障功能,表明其作为对抗皮肤衰老和改善皮肤健康的治疗剂具有良好的潜力。
1. 引言
皮肤老化是一个复杂且多因素的过程,受内在和外在因素的影响。1 随着 年龄的增长,由于胶原蛋白、弹性蛋白和透明质酸的逐渐流失,皮肤会发生各种变化,如出现皱纹和干燥。2、3、4 内在 和 外在 因素 的结合会导致皮肤外观随着衰老而逐渐发生不可避免的变化。1随着时间的推移,皮肤会变薄、弹性变差、更容易受伤。日晒、吸烟和其他生活习惯等环境因素也会影响皮肤老化。4 因此 ,预防或减缓由这些因素引起的衰老过程至关重要。
皮肤屏障对于维持皮肤水分和保护皮肤免受环境损害至关重要。5 在 衰老过程中,皮肤的天然物质(如胶原蛋白、弹性蛋白和透明质酸)会减少,从而削弱皮肤屏障。3 皮肤 屏障功能的下降会降低皮肤保护自身免受环境压力源影响的能力,从而加速皮肤老化。皮肤老化和皮肤屏障损伤的恶性循环因无保护地暴露于环境污染物、紫外线辐射和刺激性清洁剂而加剧,这些都会增加氧化应激并加速皮肤老化。6 因此 ,使用可以增强和恢复皮肤屏障的产品和做法对于延缓过早衰老的迹象至关重要。
ZAG 是一种多学科蛋白质,已在各种人体液以及前列腺、肝脏和乳腺的上皮细胞中检测到。7、8在 之前 的研究中,ZAG 治疗在特应性皮炎诱发的小鼠模型中增强了丝聚蛋白 (Flg) 的 mRNA 表达 。 它降低了与经表皮失水 (TEWL) 和炎症因子相关的基因的 mRNA 表达。9 此外 ,在正常人表皮角质形成细胞中通过 shRNA 降解ZAG mRNA 也被证明可以降低FLG表达,并且 ZAG 肽已被证明对皮肤健康有多种影响。9 尽管 ZAG 肽具有已证实的稳定性和其他有益作用,但缺乏关于其对皮肤的抗衰老作用的详细研究。因此,本研究旨在调查 ZAG 肽及其含肽产品对皮肤健康的抗衰老作用。
2.材料和方法
2.1. 参与者
本研究招募了 22 名眼眶周皱纹明显的女性患者(35-60 岁)。排除标准为:有皮肤病治疗史(例如填充剂、洗脸、纹身、肉毒杆菌和激光)、近期 3 个月内使用过与本研究中使用的类似产品、皮肤病变、过敏或超敏反应、传染性皮肤病以及对药物、化妆品或常规光照有不良反应。所有参与者都被要求每天两次涂抹 Ato 修复清洁剂、Ato 修复乳液和 Ato 修复霜(含 ZAG 肽的 Ato 修复液;L&C Bio Inc.,韩国首尔),持续 4 周。
本研究遵照《赫尔辛基宣言》进行,并经全球医学研究中心机构审查委员会(IRB)批准(IRB编号GMRC‐18614‐E1R)。试验前,向所有受试者解释产品的成分、副作用和益处,并获得受试者的知情同意。
2.2 临床疗效评价
使用 Ato Repair Solutions 4 周后,分别在基线、第 2 周和第 4 周评估其临床疗效。使用 Cutometer Dual MPA580(德国科隆 Courage Khazaka electronic GmbH)、Ultrascan UC22(Courage + Khazaka electronic GmbH)和 Antera 3D CS(爱尔兰都柏林 Miravex)、Tewameter TM300(Courage Khazaka electronic, GmbH)分别测量皮肤密度、皮肤弹性、眶周皱纹深度变化和 TEWL。还记录了不良事件,并要求参与者在 4 周试验结束时使用问卷调查对产品疗效的满意度进行评分(表S2)。问卷评估采用五分量表(非常满意 = 5、满意 = 4、稍微满意 = 3、无变化 = 2、不满意 = 1),3 分或以上视为阳性反应并作为结果呈现。
2.3. ZAG 肽与细胞培养
ZAG 肽(序列:EDWKQDSQLQKAREDIFMETLKDIVEYYND)购自 AbClon Inc.(韩国首尔)。人表皮角质形成细胞(KC;原代表皮角质形成细胞;正常;人;成人,PCS-200-011)细胞和人真皮成纤维细胞(HDF)购自 ATCC(美国弗吉尼亚州马纳萨斯)。KC 和 HFD 细胞分别在含有 KGM™ Gold SingleQuots™ 补充剂(Bullet Kit;Lonza)的 KBM™ Gold 基础培养基(Lonza,瑞士巴塞尔)和含有 10%(v/v)胎牛血清(Gibco,美国纽约州大岛)和 1% 青霉素-链霉亲和素(Gibo)的杜氏改良 Eagle 培养基(Lonza,美国马里兰州沃克斯维尔)中培养。所有细胞均在 37°C 、5% CO 2、加湿培养箱中培养。
2.4 细胞毒性测量
使用细胞计数试剂盒 8 (CCK-8;Dojindo,日本益城) 测量细胞毒性。将 KC 细胞 (5 × 10 4细胞/孔) 接种于 96 孔细胞培养板中并孵育 24 小时。以五种不同浓度 (0.25、0.5、1.0、2.0 和 4.0 μg/mL) 添加 ZAG 肽,或使用 UVB 灯 (BLX26,BIO-LINK-Crosslinker,FRA) 用紫外线 B (UVB) 照射细胞以诱导光衰老。使用 ELISA 微孔板读数仪 (VersaMax;Molecular Devices,美国加利福尼亚州) 测量 450 nm 处的吸光度。
2.5. 衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)分析
根据制造商的说明,使用衰老细胞组织化学染色试剂盒 (CS0030,Sigma-Aldrich) 测量 SA-β-Gal 活性。将 KC 细胞 (5 × 10 4细胞/孔) 接种于 6 孔板中,并用 100 mJ/cm 2紫外线照射和 2.0 µg/mL ZAG 肽处理。用磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 洗涤培养皿,并在室温 (20-25°C) 下用固定缓冲液固定 7 分钟。固定后,用 PBS 洗涤细胞三次并添加到染色混合物中。将染色的细胞在 37°C 下无 CO 2孵育过夜,然后使用显微镜 (BX43,Olympus,东京,日本) 观察并使用 ImageJ 软件 (美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院) 进行分析。
2.6. 定量逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)
使用 TRIzol试剂(Invitrogen,美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)从培养 24 小时的 KC 细胞(对照;未处理,紫外线;100 mJ/cm 2 UVB,紫外线 + ZAG;100 mJ/cm 2 UVB + 2.0 µg/mL ZAG 肽)和培养 3 天的 HDF 细胞(对照;未处理,紫外线;10 J/m 2 UVA,紫外线 + ZAG;10 J/m 2 UVA + 2.0 µg/mL ZAG 肽)中提取总 RNA,并使用 NanoDrop 分光光度计(ThermoFisher Scientific,美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)进行 RNA 质量控制。按照制造商的说明,使用 RNA 到 cDNA EcoDry Premix Kit(Takara Sake,美国加利福尼亚州伯克利)合成 cDNA。使用特异性引物对进行 qRT-PCR(表 1) 和 SYBR Green Master MIX (美国威斯康星州麦迪逊市 Promega 公司)。使用GAPDH作为管家基因来标准化 mRNA 表达水平,并使用 2‐ΔΔCt 方法估计相对 mRNA 表达水平。
2.7. 免疫荧光染色
将KC 细胞(2.5 × 10 4 个细胞/孔)接种于 4 孔腔式载玻片中并孵育 24 小时,然后用 UVB(10 J/cm 2)或 UVB(10 J/cm 2)+ ZAG 肽(2.0 µg/mL)处理。然后用 4% (w/v) 多聚甲醛(Cell Signaling Technology,美国马萨诸塞州丹弗斯)在室温下固定细胞 15 分钟,再用 PBS 清洗三次。将固定的细胞与抗 loricrin(Abcam Cambridge,英国)或抗丝聚蛋白(Abcam)抗体在 4°C 下孵育过夜。此后,将载玻片清洗三次并在室温下与 FITC 标记的二抗(山羊 pAb to Rb IgG-FITC;Abcam)孵育 2 小时。最后,用含有 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚的 VECTASHIELD 封固剂(美国加利福尼亚州伯林盖姆的 Vector Laboratories Inc.)固定载玻片。使用激光扫描显微镜(德国耶拿的卡尔蔡司 LSM 700)获取荧光图像,并使用 ImageJ 软件进行分析。
2.8. 数据分析
所有数据均以平均值±标准差或百分比表示。使用 Kolmogorov-Smirnov 检验来验证正态性。使用 Friedman 检验或 Wilcoxon 符号秩或重复测量方差分析比较基线、第 2 周和第 4 周的数据,随后使用 Bonferroni 校正进行事后分析。p值<0.05 被认为具有统计学意义。所有实验室研究均重复进行三次(n≥3)。使用 SPSS 统计版本 25.0 软件(IBM Corp.,美国纽约州阿蒙克)进行统计分析。
3.结果
3.1. 参与者特征
这项研究纳入了 22 名年龄在 35 至 60 岁之间的亚洲女性,她们的眼睛周围有明显的皱纹。患者平均年龄为 50 ± 5.31 岁。所有参与者都成功完成了研究,直到最后一次访问,没有人因不遵守规定而退出。试验 4 周后,患者没有报告任何不良事件。
3.2. 含ZAG肽的Ato修复液的临床疗效及安全性
使用 Ato 修复液 4 周后测量皮肤密度和弹性,结果显示皮肤密度显著增加(基线;11.18 ± 3.60%,第 2 周;13.45 ± 3.78%,第 4 周;14.32 ± 4.60%,重复测量方差分析, 和皮肤表面弹性 (R 2 ) (基线; 0.69 ± 0.06, 第 2 周; 0.72 ± 0.06, 第 4 周; 0.73 ± 0.06, 重复测量方差分析, 显示了 TEWL 测量结果。根据应用周数,TEWL 低于基线(基线;18.281 ± 4.517,第 2 周;16.622 ± 3.095,第 4 周;14.700 ± 2.592,重复测量方差分析,p < 0.05)。与基线(0.129 ± 0.034 毫米)相比,第 2 周(0.089 ± 0.030 毫米)和第 4 周(0.082 ± 0.026 毫米)的眶周皱纹深度(毫米)显着减少[ p < 0.025(= 5%/2);Friedman 检验和事后 Wilcoxon 符号秩检验;所有参与者均回答了主题满意度调查问卷。问卷调查对受试者的满意度评分显示,86%、86% 和 91% 的受试者对皮肤密度、皮肤弹性和眶周皱纹的改善分别给予满意的评分,评分为 ≥ 3。研究期间没有任何患者报告不良事件,也没有患者因不良事件而退出研究。这些结果表明使用含 ZAG 肽的 Ato 修复液治疗是安全的。
3.3. 评价ZAG肽对细胞毒性和细胞衰老的影响
用 2.0 μg/mL ZAG 肽和 100 mJ/cm 2 UVB 照射处理的 KC 细胞活力分别为 90.26 ± 4.76% 和 79.16 ± 11.67%(图 3A,B因此我们在后续实验中也沿用了这些处理条件。KC细胞中SA-β-半乳糖苷酶染色的代表性图像如图所示。 4AUVB 治疗组 SA-β-半乳糖苷酶染色细胞比例 (36.79 ± 1.99%) 显著高于对照组 (16.75 ± 1.62%) 。相反,ZAG肽治疗减轻了UVB引起的衰老增加;SA-β-半乳糖苷酶染色细胞的比例显著降低至23.68±2.70%。
接下来,我们评估了 ZAG 肽对细胞衰老相关基因表达的影响。qRT-PCR 分析显示, UVB 照射组的p16、p21和p53的 mRNA 表达明显高于对照组。然而,用 ZAG 肽处理 UVB 照射的 KC 细胞可显著降低这些 mRNA 的表达水平。相反,UVB 照射会增加基质金属蛋白酶 ( MMP ) 2和MMP9的表达,而用 ZAG 肽处理可显著降低这些表达。与对照组相比,UVB照射组 的组织金属蛋白酶抑制剂1( TIMP1 )的表达也降低,而ZAG肽治疗后,这种表达得到改善。这些结果证实了ZAG肽治疗因UVB照射而老化的KC细胞可能具有抗衰老作用。
3.4. ZAG肽的皮肤屏障改善效果的体外评价
使用免疫荧光染色和 qRT-PCR 评估 ZAG 肽改善皮肤屏障的潜力。结果表明,与对照组相比,UVB 照射组 的FLG染色强度降低相反,与 UVB 照射组相比,ZAG 肽治疗组 的FLG染色强度显著增加。 FLG的 mRNA 表达也观察到了类似的结果。此外,用 ZAG 肽治疗可改善 UVB 诱导的染色强度降低 和外皮蛋白 ( IVN )。这些结果表明,用ZAG肽治疗可改善体外皮肤屏障功能。
4.讨论
皮肤老化是一个复杂的过程,受内在和外在因素的影响。随着年龄的增长,我们的皮肤逐渐失去胶原蛋白和弹性蛋白,而胶原蛋白和弹性蛋白对于维持皮肤密度至关重要, 10 导致皮肤变薄、弹性降低,从而导致皱纹、下垂和其他衰老迹象。皮肤密度是维持皮肤保持水分、愈合、再生和保护身体能力的决定性因素。11 因此 ,皮肤密度低会导致皮肤干燥,加速衰老迹象。我们的研究使用体外和临床评估调查了 ZAG 肽对皮肤老化和屏障功能的影响。对眼眶周围皱纹明显的患者进行以 ZAG 肽为主要成分的 Ato 修复液的临床评估显示,它具有改善皮肤密度和弹性以及减少眼眶周围皱纹深度的潜力。此外,使用 KC 细胞进行体外实验,我们的结果表明 ZAG 肽使用安全,具有抗衰老和改善皮肤屏障的作用。这些结果表明 Ato 修复液是治疗明显眶周皱纹的有效抗衰老剂。
SA-β-半乳糖苷酶与动物细胞的衰老过程有关,被认为是皮肤衰老的主要原因之一。12 它 在胶原蛋白和构成皮肤细胞外环境的其他分子的分解中的作用导致皮肤衰老。13 在 本研究中,我们发现用 ZAG 肽治疗可显著降低 UVB 照射的 KC 细胞中 SA-β-半乳糖苷酶染色细胞的比例。这些结果表明 ZAG 肽有可能通过抑制 SA-β-半乳糖苷酶的活性来减少 KC 细胞中 UVB 照射引起的衰老。
p16、p21和p53与衰老和皮肤老化密切相关。p16 表达增加与胶原蛋白生成减少有关,从而导致老化皮肤中出现皱纹。14 p21 的表达与受损蛋白质的积累和衰老细胞的形成有关,从而导致与年龄相关的皱纹和皮肤弹性增加。15、16 先前 的研究表明,负责调节细胞周期进程和分化的p53的表达与细胞衰老和皱纹的形成 有关 。17、18、19我们的研究 结果 显示,与 UVB 照射组相比,ZAG 肽治疗组中这些基因的表达显著降低,这表明 ZAG 肽对 KC 细胞衰老的减弱是通过抑制衰老相关基因 p16 、p21和p53的表达来实现的。
MMP2、MMP9和TIMP1也与导致皮肤老化的胶原蛋白降解有关。MMP2 和 MMP9 蛋白会降解蛋白质、胶原蛋白和弹性蛋白之间的界面,而这些界面决定了皮肤的结构强度。20、21 TIMP1 可 抵消MMP 的作用并保护皮肤结构。22 我们 在此证明 ZAG 肽降低了受 UVB 照射的 KC 细胞中MMP2和MMP9的表达并诱导了TIMP1的表达,这表明 ZAG 肽的抗衰老作用是通过调节这些基因来调节的。此外,皮肤老化是在含有 KC 和成纤维细胞的整个皮肤中发生的,UVA 照射加 ZAG 肽治疗组的 MMP3、MMP9 和 p53 基因表达明显低于 HDF 细胞的 UVA 照射组,这表明 ZAG 肽治疗不仅对 KC 细胞而且对成纤维细胞都有抗衰老作用
皮肤屏障保护皮肤免受环境损害,如紫外线辐射和刺激性化学物质,并防止水分流失、免疫反应和炎症。FLG 是形成皮肤屏障和防止水分流失的必需蛋白质,而 IVN 参与产生表皮脂质,有助于保持皮肤水分。23、24 我们 的 结果表明,ZAG 肽增加了 UVB 照射的 KC 细胞中FLG和 IVN 的染色强度,并增加了FLG和IVN的 mRNA 表达。这些发现表明 ZAG 肽具有改善皮肤屏障功能、减少皱纹和 TEWL 的潜力。
尽管这项研究对 ZAG 肽的潜在抗衰老作用提供了有希望的结果,但仍有几个局限性需要考虑。首先,这项研究是使用体外实验和临床试验进行的,样本量相对较小。因此,需要进行更大规模、更多样化人群的临床试验,以进一步验证 ZAG 肽对抗皮肤衰老的功效。此外,ZAG 肽抗衰老作用的详细机制仍不清楚,需要进一步研究才能充分了解所涉及的分子机制。最后,本研究重点关注了 ZAG 肽对皮肤屏障、胶原蛋白降解和衰老的影响。然而,尚未研究 ZAG 肽对皮肤衰老其他方面(如色素沉着和炎症)的影响。
总之,我们的研究提供了证据,证明 ZAG 肽可能是一种有前途的皮肤老化治疗剂。在临床环境中,使用含有 ZAG 肽的 Ato 修复液可改善皮肤密度、弹性和皱纹。我们的体外实验表明,ZAG 肽通过降低 SA-β-半乳糖苷酶的活性并通过抑制p16、p21和p53的表达减弱衰老诱导,对 KC 细胞发挥潜在的抗衰老作用。此外,ZAG 肽降低了MMP2和MMP9的表达并诱导了TIMP1的表达,这可能有助于其抗衰老作用。最后,ZAG 肽增加了FLG和IVN的表达,它们是皮肤屏障功能的重要组成部分。总之,根据 FLG 和 IVN 表达增加而改善的皮肤屏障,皮肤密度和弹性增加,TEWL 和皱纹减少。此外,在基因表达水平的结果中,衰老和皱纹相关基因得到改善。这些结果证明了我们想要提出的 ZAG 肽抗衰老机制。然而,验证我们的研究结果以探索 ZAG 肽的治疗益处并了解其抗衰老作用的确切机制仍需要进一步研究。
原始出处:
Lee SG, Ham S, Lee J, Jang Y, Suk J, Lee YI, Lee JH. Evaluation of the anti-aging effects of Zinc-α2-glycoprotein peptide in clinical and in vitro study. Skin Res Technol. 2024 Mar;30(3):e13609. doi: 10.1111/srt.13609. PMID: 38419415; PMCID: PMC10902615.
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